超详细的3T3-L1细胞成脂诱导操作指南

3T3-L1细胞是一种小鼠胚胎成纤维细胞系，最早于1974年由Green和Kehinde等人从小鼠胚胎中分离得到。由于其具备在体外分化为类脂肪细胞的能力，这种细胞系被广泛应用于肥胖和糖尿病等代谢性疾病的研究中。

本期细胞学堂将详细解读3T3-L1细胞的成脂诱导分化步骤及注意事项，帮助您轻松掌握实验技巧，确保实验顺利进行。

本次实验使用代次为P5的细胞进行诱导分化，但具体以当下的细胞状态为准。为了确保实验结果的准确性和可靠性，建议尽量使用早代次的细胞开始诱导分化实验。

注：此次3T3-L1细胞成脂诱导实验是普诺赛内部测试数据，仅供参考。

3T3-L1细胞成脂诱导分化步骤

（以六孔板为例）

1、3T3-L1（小鼠胚胎成纤维细胞）正常培养，细胞的融合度达到80~90%时，即可用胰酶消化，计数。

2、按2~3×104 cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中（具体接板数量以实际预实验情况为准），每孔加入2 mL的3T3-L1细胞完全培养基。

3、将均匀接种好的3T3-L1细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。

4、当细胞融合度达到90%~95%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL的3T3-L1细胞成脂诱导分化培养基A液开始诱导。

5、A液诱导2天后，吸走六孔板的诱导完全培养基，每孔加入2 mL 3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)成脂诱导分化培养基B液完全培养基维持培养1天。

6、使用A 2天+B 1天交替的方法持续诱导。

7、诱导试剂配制方法可参考3T3-L1 (小鼠胚胎成纤维细胞) 成脂诱导分化培养基的说明书，并按照说明书操作对诱导结束后的细胞进行油红O染色。

诱导分化结果展示

3T3-L1细胞诱导前，细胞融合度达到90%~95%左右：

诱导前镜下图

用3T3-L1 （小鼠胚胎成纤维细胞） 成脂诱导分化培养基（PD-031）诱导第8天结果如下：

诱导第8天，未染色效果图

诱导第8天，油红O染色效果图

滴量（大颗脂滴），可适当延长诱导时间。用3T3-L1（小鼠胚胎成纤维细胞）成脂诱导分化培养基诱导第16天结果如下：

诱导第16天，未染色效果图

诱导第16天，用油红O染色效果图

诱导注意事项

1、开始诱导时的密度可控制在90%~95%或者刚好长满，注意避免细胞过度饱和导致细胞卷边漂起或者状态不佳，这可能会影响后续的分化效果。

2、铺板需均匀，铺板不均匀可能会导致分化不均匀，分化比例低，分化过程中细胞漂浮。

3、从添加诱导剂开始到分化结束，大概需要2周左右的时间（具体还需根据脂滴出现的情况，适当延长或者缩短诱导时间）。

4、3T3-L1细胞添加诱导剂时，手法要特别轻，诱导试剂需要提前37℃复温后使用，加液时尽量用枪头贴壁逐滴加入，让液体慢慢流下，这样对细胞的冲击最小，否则极容易造成细胞卷边飘起。

5、实验中所使用的溶剂遵循现用现配原则。

6、染色使用的油红O染色液需要按说明书稀释后使用，饱和油红O染色液不容易着色。

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参考文献

[1] Zebisch K ,  Voigt V ,  Wabitsch M , et al. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes[J]. Analytical Biochemistry, 2012, 425(1):88-90.

[2] 张晓琴. 优化3T3L1细胞成脂诱导模型并初步探讨miR-222-3p对脂肪生成的作用[D]. 湖北中医药大学, 2020.

[3] 王友升, 田元元, 蔡琦玮. 前体脂肪细胞3T3-L1诱导分化条件的优化[J]. 食品科学技术学报, 2014, 32(3):5.